Las tecnologías de edición del genoma se han convertido en herramientas valiosas en muchos aspectos de la investigación científica, facilitando, por ejemplo, la identificación de genes implicados en el desarrollo o la determinación de las funciones de las proteínas. Funcionan creando rupturas dentro del genoma, que luego se reparan al volver a unir los extremos del ADN. A menudo se producen errores durante este proceso, lo que puede conducir a mutaciones de pérdida de función. Además, como ambas hebras del ADN se rompen, brinda la oportunidad de incorporar nuevas secuencias de ADN en el genoma.
El sistema CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) / Cas (asociado a CRISPR) es uno de esos métodos de edición del genoma. Se ha vuelto difícil de ignorar, ya que ha recibido una gran atención tanto de la comunidad científica como de los medios. Una historia que recibió una cobertura significativa fue la aprobación de un laboratorio, con sede en Londres, para utilizar la edición del genoma CRISPR en embriones humanos. Varios artículos también han demostrado la gran cantidad de aplicaciones potenciales de esta técnica en animales, por ejemplo, producir ganado que no desarrolle cuernos y, por lo tanto, evitar la necesidad de someterse a procedimientos dolorosos para extirparlos. La razón de tanto entusiasmo por CRISPR se debe, en parte, a su simplicidad y eficacia.
El sistema CRISPR tipo II requiere solo un crRNA (crRNA), un crRNA transactivador (tracrRNA) y una proteína Cas9. Las secuencias de ARN se pueden fusionar para crear un único ARN guía (ARNg). Esto se puede reprogramar cambiando una región de 20 pb conocida como secuencia espaciadora, para dirigir la proteína Cas a casi cualquier región dentro del genoma, denominada protoespaciador. La proteína Cas9 reconoce una secuencia de reconocimiento de 3 pb dentro del genoma, conocida como motivo adyacente protoespaciador (PAM). Esto le permite unirse e introducir una ruptura dentro de la secuencia de ADN, exactamente 3 pb aguas arriba del PAM (belhaj et al., 2013). A diferencia de las técnicas alternativas para introducir roturas de ADN, como TALEN, varias regiones genómicas pueden dirigirse fácilmente simplemente modificando las secuencias de ARN utilizadas para dirigirse a la proteína Cas.
Un estudio reciente de Gao et al. (2016) intentó diseñar una forma de identificar efectivamente las mutaciones hereditarias creadas usando CRISPR/Cas9 en la generación T2 de Arabidopsis. Actualmente, las técnicas utilizadas son lentas y laboriosas. Al incluir una proteína fluorescente dentro del plásmido CRISPR, bajo un CRISPR / Cas9 promotor del vector, los autores pudieron seleccionar fácilmente las semillas de la planta mutada que aún expresaban la proteína Cas9 utilizando técnicas de microscopía simples. Esto es importante cuando se trata de determinar si una mutación es hereditaria, ya que es probable que una planta T2 que aún exprese la construcción CRISPR tenga una mutación debido a la actividad continua de Cas9 en lugar de haberla heredado de la planta madre.
Una desventaja significativa del sistema CRISPR son los altos niveles de mutaciones fuera del objetivo que pueden introducirse como resultado. Esto hace que sea importante determinar con precisión si el Cas9 El gen se ha segregado, ya que las plantas que continúan expresando la proteína Cas9 tienen muchas más probabilidades de desarrollar estas modificaciones indeseables en otras partes del genoma. Además, la expresión continua podría llevar a que las mutaciones somáticas se identifiquen falsamente como hereditarias, lo que aumenta en gran medida el tiempo necesario para detectar plantas que contengan las mutaciones derivadas de CRISPR/Cas9 en las generaciones posteriores.
Varios estudios han informado el uso exitoso de CRISPR/Cas9 en plantas (Bortesi y Fischer, 2015), sin embargo, se puso poco énfasis en garantizar que la proteína Cas9 se hubiera segregado. Los estudios futuros, en particular aquellos que requieren mutaciones hereditarias, deberían centrarse más en aquellas plantas que contienen la mutación sin una expresión continua de la construcción CRISPR/Cas9. Esto reducirá significativamente el tiempo de detección de las plantas que contienen las mutaciones derivadas de CRISPR/Cas9 y reducirá la probabilidad de mutaciones fuera del objetivo en otras partes del genoma. Actualmente, este trabajo se realizó utilizando el organismo modelo popular Arabidopsis, pero será interesante ver si tales técnicas pueden ampliarse para su uso en otros sistemas de plantas.
