¿Qué sucede detrás de estos muros? Esta pregunta fundamental ha fascinado a generaciones de botánicos desde la primera observación microscópica de células vegetales en 1665, y seguramente entretendrá a muchos más en los siglos venideros. Desde entonces hemos aprendido mucho sobre el funcionamiento interno de las plantas. Sin embargo, muchos de estos descubrimientos no se realizaron mediante imágenes directas, sino mediante mediciones indirectas seguidas de deducciones razonables. Las coloridas representaciones de los procesos intracelulares que se encuentran en los libros de texto son, en gran medida, aproximaciones de lo que se puede concluir después de extraer el contenido celular, agitarlo en tubos de ensayo con algunos productos químicos, pasar este cóctel por máquinas costosas y observar los números de estos instrumentos. escupir durante el tiempo suficiente. No son imágenes reales de lo que es, sino imaginaciones reflexivas de lo que podría ser. Durante mucho tiempo, lo más cerca que los científicos pudieron llegar a una representación realista fueron las imágenes citológicas tomadas a partir de preparaciones histológicas de tejido muerto después de su fijación y tinción. Estas fueron instantáneas momentáneas congeladas en el tiempo y el espacio y no revelaron nada sobre los procesos dinámicos, dejando a los investigadores en la oscuridad sobre las actividades internas que definen la vida.

Sin embargo, a mediados del siglo XIX ya se había descubierto una manera de hacer visible lo invisible.th-siglo por el físico George Gabriel Stokes en una solución de quinina. El líquido transparente e incoloro se iluminó en un azul celeste cuando se colocó en el borde mismo de un espectro de luz solar dispersado por un prisma. Asombrado por lo que había presenciado, Stokes escribió: “Sin duda fue un espectáculo curioso ver cómo el tubo se iluminaba instantáneamente al sumergirse en los rayos invisibles.: Era literalmente oscuridad visible. En conjunto, el fenómeno tenía una apariencia algo sobrenatural..” Es este fenómeno el que hoy maravilla a los nocturnos cuando disfrutan de su gin tonic junto a una luz negra, la misma que elevó a un biólogo marino japonés al ámbito de los Premios Nobel y la que tiene el poder de arrojar luz sobre la dinámica intracelular. y revolucionó la biología molecular.

Stokes acuñó la emisión de luz que observó como "fluorescencia", y ocurre cuando ciertos átomos o moléculas son excitados por la luz de una longitud de onda particular y emiten luz de una longitud de onda más larga después de un tiempo muy corto. Alrededor de un siglo después de Stokes, Osama Shimomura recolectó cerca de 10,000 ejemplares de medusa. aequorea victoria en aguas del Pacífico para resolver el misterio del atractivo brillo del animal y extrajo con éxito una proteína verde fluorescente (GFP). Pasarían otros 30 años aproximadamente hasta que se secuenciara y clonara GFP, lo que permitió su expresión en otros organismos y la convirtió en una herramienta hoy en día indispensable para la investigación no invasiva. in vivo Análisis de actividades fisiológicas a nivel subcelular u organismo.

La mutagénesis dirigida de la GFP original ha producido una amplia gama de moléculas productoras de fluorescencia, llamadas fluoróforos, con diferentes propiedades fotofísicas. De este modo, se pueden visualizar diferentes proteínas simultáneamente utilizando etiquetas fluorescentes espectralmente separadas. De esta manera se puede detectar no sólo su localización, sino también cualquier posible interacción entre proteínas de interés. Para que las proteínas interactúen, deben estar a una distancia muy cercana de sólo unos pocos nanómetros. Cuando la distancia entre los fluoróforos unidos se vuelve lo suficientemente pequeña, la energía de un rayo láser absorbido por uno puede transferirse al otro, lo que disminuye la vida útil de la fluorescencia y el rendimiento de emisión de luz del fluoróforo donante y aumenta la fluorescencia del aceptor. Esta llamada transferencia de energía por resonancia de Förster (FRET) se registra y analiza en microscopía de imágenes de fluorescencia durante toda la vida (FLIM), una técnica que permite a los investigadores medir cuánto tiempo permanece un fluoróforo en estado excitado antes de producir luz.

Sin embargo, el uso del análisis de fluorescencia en plantas es un desafío notorio debido a la alta autofluorescencia interna de compuestos como la clorofila o la lignina de la pared celular. Por lo tanto, las señales de proteínas poco abundantes marcadas con fluorescencia a menudo quedan ahogadas por la “contaminación lumínica” interna. Las soluciones alternativas para aumentar la relación señal-ruido, como la expresión de proteínas bajo promotores más fuertes, pueden provocar fácilmente artefactos y una mala interpretación de los datos.

Petutschnig et al. (2024) Presentar un nuevo par de fluoróforos con excelente brillo que se pueden utilizar para métodos no invasivos. in vivo análisis de interacción de proteínas como se ilustra en estas células epidérmicas de plantas de Arabidopsis. El panel izquierdo muestra la vida útil de la fluorescencia de los fluoróforos cuando se expresan individualmente. En el panel derecho, mCitrine y mScarlet-I se combinaron para formar una proteína de fusión. La estrecha proximidad entre los fluoróforos permite la transferencia de energía desde el mCitrino donante al aceptor mScarlet-I, lo que reduce significativamente la vida útil del donante. 

Para superar estas limitaciones, la Dra. Elena Kristin Petutschnig y sus colegas han estableció un nuevo par de fluoróforos Con propiedades superiores, que presentaron recientemente en la Revista de Botánica Experimental. El donante fluorescente mCitrine y el aceptor mScarlet-I (denominados así por sus respectivas emisiones de luz amarilla y roja) se superponen en sus espectros de absorción y emisión de luz, un requisito previo para estudiar la interacción de proteínas mediante FRET/FLIM. Presentan un brillo excelente y, por lo tanto, son ideales para proteínas con bajos niveles de expresión. Los autores han validado la funcionalidad de los fluoróforos utilizando dos partes de un complejo receptor celular que detecta un compuesto fúngico y desencadena una respuesta de defensa vegetal, y revelaron detalles previamente desconocidos sobre la interacción de los componentes. Por lo tanto, se ha demostrado que el par de fluoróforos arroja nueva luz sobre los procesos intracelulares, y el trabajo tiene un gran potencial para esclarecer aún más lo que sucede detrás de las paredes celulares de las plantas.

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Petutschnig EK, Pierdzig L, Mittendorf J, Niebisch JM, Lipka V. 2024. Un nuevo par de proteínas fluorescentes facilita el análisis FLIM-FRET de la interacción del receptor inmunológico de las plantas en condiciones nativas. Diario de botánica experimental 75, 746-759. https://doi.org/10.1093/jxb/erad418

Mareike Jezek

El Dr. Jezek es editor asistente del Journal of Experimental Botany, una de las revistas oficiales del Sociedad de Biología Experimental.